相差顯微鏡觀測熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞三維培養(yǎng)

提供給你一種成熟視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞三維培養(yǎng)方法：

1大鼠培養(yǎng)網(wǎng)膜的獲得 10周齡的Wistar系大鼠，乙醚麻醉后摘出完整眼球，在顯微鏡下依次除去角膜，鞏膜和脈絡(luò)膜，再除去晶體和玻璃體，分離網(wǎng)膜。上述操作要求動(dòng)作輕巧快速準(zhǔn)確，分離網(wǎng)膜時(shí)，要把玻璃體完全清除干凈。切除周邊網(wǎng)膜，取距視盤1至1.5mm處網(wǎng)膜，切成邊長500μm的方形網(wǎng)膜片16片,顯微鏡。上述操作要求在培養(yǎng)液內(nèi)完成，無菌操作，避免細(xì)菌污染。

.2 網(wǎng)膜片的培養(yǎng) 在0℃環(huán)境下，將配置好的膠原溶液滴于用10 mg•L-1多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)孔中央，形成直徑15mm的膠原溶液層。膠原溶液由以下成分組成:①用CH3COOH溶液稀釋的0.3%Ⅰ型膠原(從大鼠尾巴提取)pH3.0;②10倍濃度的MEM培養(yǎng)液; ③每100ml含NaHCO3 2.20g和Hepes 4.77g的0.05N NaOH。①: ②: ③=8:1:1。將網(wǎng)膜片的神經(jīng)纖維層向下浸入膠原溶液層中，每孔4片。37℃水浴5min。液態(tài)膠原凝固成盤狀凝膠，網(wǎng)膜片固定在其中（附圖）。培養(yǎng)孔中加入培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃恒溫箱中。隔日換培養(yǎng)液。培養(yǎng)液成分如下: 不含血清的MEM，2.7 g•L-1的葡萄糖，5 mg•L-1的胰島素，16.1 mg•L-1的肉毒堿，792 mg•L-1的小牛血清白蛋白,金相顯微鏡價(jià)格，5.2μg•L-1的Na2SeO3，3.7g•L-1的NaHCO3，3.6 g•L-1的Hepes。用相差顯微鏡觀察生長情況。